03 март 2019
0
Эфирное масло Душицы при раковых заболеваниях
Хотите узнать про эфирные масла от рака?

Природные соединения работают аналогично химиотерапии


Эфирное масло Майоран, Орегано и Душица – это одно и то же. Origanum majorana и Origanum vulgare - это два растения, относящиеся к одному виду, просто растут в разных регионах. Origanum vulgare - северное растение, на гористой местности. Origanum majorana- растет на юге, его мы знаем как майоран.

Обзор природных средств для лечения рака уже сегодня


Из клинического исследования, отраженного в PubMed (международная, основная база данных медицинских и биологических клинических исследований): "Обычные лекарства для лечения рака направлены на подавление прогрессирования клеточного цикла и на индукцию клеточной гибели и апоптоза. Химиопрофилактика рака с помощью этих двух событий (остановка клеточного цикла и апоптоз) была отмечена для нескольких природных соединений."

Какие эфирные масла лечат раковые заболевания?


На сегодня открыто 5 растений, которые УСПЕШНО могут бороться с раковыми клетками, вызывая апоптоз этих клеток (Душица, Ладан, Розмарин, Чабрец, Ромашка). Уже много доказательств живых людей, поборовших рак груди и рак кожи, применяя эти натуральные средства без побочных эффектов. Рак кожи наиболее вылечиваемое заболевание, потому что воздействие можно предпринять непосредственно на пораженный участок. А натуральные средства очень зависимы от концентрации и продолжительности воздействия, что явно отражено в статье.

Не кожные типы рака, находящиеся глубоко в организме, а не на поверхности, в чашке петри хорошо поддаются лечению, как рак мозга или лимфома (колонии раковых клеток выращенные для эксперимента). Но, как добраться до них в реальном живом организме пока не ясно и требуются дальнейшие клинические исследования.

Противораковые свойства эфирного масла Орегано (Душица)


Клинически НЕОДНОКРАТНО подтверждено, что Дущица вызывает апоптоз раковых клеток.

Существующие многочисленные проверенные исследования и гораздо более продвинутые и углубленные, предстоящие исследования свойств масла Орегано (душица, майоран) на противораковые свойства имеют далеко идущие последствия.

Рак мозга


Канадские исследователи пришли к выводу, что карвакрол, активное свойство масла орегано, уменьшает миграцию рака, инвазию и жизнеспособность клеток глиобластомы U87, опасной формы опухоли головного мозга.

Рак молочной железы


Исследования показали, что орегано обладает активностью в отношении MCF-7, клеток рака молочной железы. Распространенные виды рака дыхания, инфильтрирующая протоковая канцерма, эстроген-рецептор-положительный, прогестерон-рецептор-положительный. Другое исследование, проведенное в 2011 году во Франции, обнаружило противораковую активность орегано против клеток рака молочной железы MCF-7. Исследование заявляет, что орегано имеет высокую концентрацию антиоксидантов и мощный антималярийный эффект.

Лейкемия


Исследование, проведенное в Индии в 2016 году, пришло к выводу, что карвакрол в масле орегано вызывал апоптоз и оказывал цитотоксическое (токсическое воздействие на раковые клетки) действие на клетки острого промиелоцитарного лейкоза HL-60 и клетки Т-лимфоцитов Jurkat.

Колоректальный рак 


Согласно исследованиям, проведенным в Бразилии в 2014 году, орегано ингибирует рост раковых клеток в клетках аденокарциномы толстой кишки человека HT-29 в пробирках. А китайское исследование, проведенное в 2015 году, показало, что карвакрол в масле орегано обладает противоопухолевой активностью в отношении двух клеточных линий колоректального рака. Кроме того, исследование утверждает, что оно уменьшает распространение опухолевых клеток, способствует апоптозу и остановке клеточного цикла, а также обладает многими другими противоопухолевыми эффектами. Даже в индийском исследовании на животных сделан вывод, что карвакрол обладает защитным действием против колоректального рака.

Для каких типов рака можно применять Душицу уже сейчас?


Лучше всего активные вещества воздействуют на видимые участки опухолевых клеток, как при раке кожи. Уже сейчас совершенно точно можно применять для рака кожи и груди. К маслу Душицы обязательно добавьте масло Чабрец, Розмарин, Ладан, Майоран. Масло душицы довольно жгучее, вызывает покраснение, начинайте с 3к на 10мл. Если все нормально, увеличьте концентрацию масла, так как раковые клетки зависимы от концентрации масла, что хорошо видно в отчете.

Как применять эфирное масло от рака кожи?


Эфирное масло Душицы наносить непосредственно на место поражения апликациями 12 раз в день, в течении недели непрерывно.

Как применять эфирное масло от рака груди?


Эфирное масло Душицы (5 капель) смешать с 10 мл базового масла (жожоба) втирать в грудь и вокруг 12 раз в день (каждый час), вызывая оптимальное накопление (концентрацию) активного вещества в клетках груди

Результаты Большого Клинического исследования Душицы против раковых клеток


"Апоптоз в клетках рака молочной железы, индуцированных экстрактом майорана ориганума: активация TNF-α и подавление сурвивина и мутанта p53"

В настоящем исследовании мы исследовали влияние этанольного экстракта майорана на выживание высокопролиферативной и инвазивной тройной негативной p53 мутантной линии клеток рака молочной железы MDA-MB-231.

Результаты


Мы обнаружили, что экстракт O. majorana (OME) способен ингибировать жизнеспособность клеток MDA-MB-231 в зависимости от времени и концентрации. Влияние ОМЕ на жизнеспособность клеток было дополнительно подтверждено ингибированием роста колоний. Мы показали, в зависимости от используемой концентрации, ОМЕ вызывал различные эффекты на клетки MDA-MB 231. Концентрации 150 и 300 мкг / мл вызывали накопление апоптотически резистентной популяции клеток, арестованных в митотисе и сверхэкспрессирующих ингибитор циклин-зависимой киназы, р21 и ингибитор апоптоза, сурвивин. С другой стороны, более высокие концентрации ОМЕ (450 и 600 мкг / мл) запускают массивный апоптоз через внешний путь, включая активацию фактора некроза опухоли-α (TNF-α), каспазы 8, каспазы 3 и расщепления PARP, подавление сурвивина, а также истощение мутанта р53 в клетках MDA-MB-231. Кроме того, OME индуцировал активацию γ-H2AX, маркера двухцепочечных разрывов ДНК и общего гиперацетилирования гистонов H3 и H4.

Заключение


Наши результаты убедительно свидетельствуют о том, что O. majorana может быть многообещающим химиотерапевтическим и терапевтическим кандидатом против рака, особенно при высокоинвазивном тройном негативном мутанте р53, раке молочной железы; подтверждая тем самым его дополнительное и альтернативное медицинское использование.

Вступление


Рак молочной железы является наиболее часто диагностируемым раком среди женщин и занимает второе место в качестве причины смерти от рака у женщин после рака легких. По оценкам, в 2019 году среди женщин в США будет зарегистрировано 226 870 новых случаев инвазивного рака молочной железы. Установлено, что растения являются отличным источником новых лекарств, в том числе противоопухолевых средств.

Идентификация и разработка новых химиотерапевтических агентов из растений получили значительное признание в области терапии рака и стали основной областью экспериментальных исследований рака. Большинство химиотерапевтических препаратов, используемых при лечении рака, происходит либо из растительного происхождения, либо из химически измененных растительных продуктов и фитохимикатов. 

На самом деле, противоопухолевые препараты растительного происхождения гораздо более эффективны и не имеют больших побочных эффектов по сравнению с синтетическими препаратами. Примеры противоопухолевых препаратов, полученных из растений и применяемых в настоящее время в клинической практике, включают алкалоиды барвинка, винбластин и винкристин, выделенные из Catharan roseus, терпеновый паклитаксел из Taxus brevifolia Nutt. И ингибитор ДНК-топоизомеразы камптотецин из Camptotheca acuminata.

Фитохимические вещества проявляют свой химиопрофилактический эффект канцерогенеза через несколько механизмов. К ним относятся ингибирование генотоксических эффектов, усиление антиоксидантов и противовоспалительной активности, модуляция клеточных сигнальных путей и изменение экспрессии генов для ингибирования пролиферации клеток и / или индукции апоптоза.

Хорошо известно, что рак является патологическим состоянием, которое связано с аберрантно регулируемым апоптозом. В настоящее время принято считать, что некоторые фитохимические вещества и экстракты цельных растений могут влиять на общий процесс канцерогенеза по нескольким механизмам. Поскольку апоптоз обеспечивает физиологический защитный механизм для устранения генетически поврежденных клеток, инициированные клетки или клетки прогрессировали до злокачественного образования; Фитохимические вещества, влияющие на апоптоз, могут оказывать существенное влияние на канцерогенез.

Все большее число исследований показали доказательства химиопрофилактики и химиотерапии путем стимуляции апоптоза в предраковых и раковых клетках in vitro или in vivo, что позволяет предположить, что апоптоз, вероятно, является ключевым механизмом подавления канцерогенеза. Epigallocatechin gallete (EGCG) (из зеленого чая), куркумин (Curcuma longa), кверцетин (овощи и фрукты) являются некоторыми примерами химиопрофилактических агентов природного происхождения, которые вызывают апоптоз в моделях канцерогенеза или в исследованиях по химиопрофилактике у человека. Кроме того, ряд растительных экстрактов, таких как черника, грибы, гингерол и многие другие, как было показано, обладают противоопухолевым действием против клеток рака молочной железы.

Origanum майорана принадлежит к семейству Lamiaceae. Это широко известно как майоран. Это многолетнее травянистое растение, широко распространенное во всем мире. Большое количество известных видов рода Origanum используются во всем мире в качестве специй и вкусовых добавок и имеют долгую историю как кулинарного, так и медицинского применения. O. majorana используется в качестве домашнего средства для лечения инфекции грудной клетки, кашля, ангины, ревматических болей, нервных расстройств, расстройств желудка, сердечно-сосудистых заболеваний и ухода за кожей. Многие из таких традиционных видов использования майорана были подтверждены в нескольких исследованиях с использованием подходов как in vitro, так и in vivo.

Несколько сообщений указывают на то, что О. майорана очень богата фенольными соединениями. Высокое содержание фенольных соединений в оригане обладает способностью поглощать свободные радикалы и, как показано, связано с сильной антиоксидантной активностью. Было показано, что O. marjorana содержит фенольные терпеноиды (тимол и карвакрол), флавоноиды (диосметин, лютеолин и апигенин), дубильные вещества, гидрохинон, фенольные гликозиды (арбутин, метил-арбутин, витексин, ориентин и тимонин) и тритерпеновые кислоты и тритерпеноиды и (тритерпеноиды) олеаноловая кислота).

Сообщалось, что O. majorana обладает значительной антимикробной активностью. Несколько исследований также показали, что этанольные, водные экстракты и эфирное масло O. majorana могут защищать от повреждения печени и почек и генотоксичности, вызванной ацетатом свинца. Также было обнаружено, что O. majorana ингибирует агрегацию и секрецию тромбоцитов. Кроме того, было показано, что это растение проявляет низкую цитотоксичность в отношении нескольких клеточных линий гепатомы. Аль Харби показал, что экстракт O. majorana уменьшал побочные эффекты, вызванные циклофосфамидом, признанным противораковым препаратом, без изменения его цитотоксичности.

В настоящем исследовании мы исследовали влияние этанольного экстракта майорана майорана (OME) на клетки рака молочной железы. Мы исследовали влияние ОМЕ на жизнеспособность клеток, клеточный цикл, апоптоз и уровни нескольких белков клеточного цикла и белков, контролирующих апоптоз, в высоко пролиферативных и инвазивных рецепторах эстрогенных (ER) негативных мутантных клеточных линиях рака молочной железы p53 MDA-MB- 231. Наши результаты демонстрируют, что OME может ингибировать рост клеток MDA-MB-231, вызывая остановку клеточного цикла и апоптоз в зависимости от подавления активности сурвивина и мутанта р53.

Материалы и методы


Приготовление этанольного экстракта майорана 


Origanum marjorana, широко известный как «майоран» и используемый в качестве кулинарной травы, был получен на частной коммерческой ферме, расположенной в районе Тира в Ливане. Все необходимые разрешения были получены для уборки листьев. Идентичность сухих листьев ОМ, использованных в этом исследовании, была дополнительно подтверждена таксономистом растений. 5,0 г высушенных листьев измельчали до тонкого порошка с использованием фарфоровой ступки и пестика. Порошок суспендируют в 100 мл 70% -ного абсолютного этанола и смесь выдерживают в темноте в течение 72 часов при 4 ° С в холодильнике без перемешивания. Затем смесь фильтровали через воронку из спеченного стекла, и фильтрат упаривали досуха с использованием ротационного пара при комнатной температуре. Зеленый остаток выдерживали в вакууме 2–3 часа и его массу регистрировали.

Клеточная культура и реагенты


Клетки рака молочной железы человека MDA-MB-231 содержались в DMEM (Hyclone). Культуральные среды были дополнены 10% эмбриональной бычьей сывороткой (invitrogen), 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина (invitrogen). Антитела к р21 (556431), PARP (556494) были получены от BD Pharmingen. Антитела к фосфору-H2A.X (ser139) (07–164), ацетил-гистону H3 (06–599), ацетил-гистону H4 (06–866) и фосфору-гистону H3 (ser10) (05–1336), p53 (E26, 04–241) и циклин B1 (05–373) были получены из Millipore. Антитела к сурвивину (sc-17779), β-актину (C4, sc-47778), козьему антимышиному IgG-HRP (sc-2005) и козьему анти-кроличьему IgG-HRP (sc-2004) были получены от Santa Cruz Biotechnology, Inc. Антитело к TNF-α (ab9739) было получено из abcam, и антитела козьего анти-кроличьего IgG AlexaFluor 488 (H + L) (A11008), козьего антимышиного IgG AlexaFluor 594 (H + L) были (A11005) были полученный из invitrogen.

Высев


Клетки высевали в трех экземплярах в 96-луночные планшеты с плотностью 5000 клеток / лунку в 96-луночные планшеты. Через 24 ч культивирования клетки обрабатывали увеличивающимися концентрациями ОМЕ или равным объемом носителя (этанола) в качестве контроля и инкубировали в течение указанного периода времени. Жизнеспособность клеток определяли с использованием анализа жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo (Promega Corporation, Madison, USA), основанного на количественном определении АТФ, который сигнализирует о наличии метаболически активных клеток. Люминесцентный сигнал измеряли с помощью люминометра Berthold FB12. Данные были представлены как пропорциональная жизнеспособность (%) путем сравнения обработанной группы с необработанными клетками, жизнеспособность которых предполагается равной 100%.

Измерение активности каспазы 3/7, 8 и 9.


Клетки MDA-MB-231 высевали с плотностью 5000 клеток / лунку в 96-луночный планшет в трех экземплярах и обрабатывали указанными концентрациями ОМЕ или равным объемом носителя (этанола) в качестве контроля в течение 24 и 48. Каспаза-3/7 8 и 9 активности измеряли с использованием люминесцентного набора для анализа каспазы-Glo 3/7, каспазы 8 и каспазы 9 (Promega Corporation, Madison, USA), следуя инструкциям производителя. Вкратце, реагенты каспазы добавляли в трехкратные лунки 96-луночного планшета, который затем смешивали в орбитальном шейкере и инкубировали в течение 2,5 часов при комнатной температуре в темноте. Люминесцентный сигнал измеряли, как описано выше.

Проточный цитометрический анализ клеточного цикла


Клетки MDA-MB 231 высевали в 100-миллиметровые культуральные чашки и культивировали в течение 24 часов перед добавлением различных концентраций ОМЕ или равного объема носителя (этанола) в качестве контроля. После инкубации в течение указанного времени клетки собирали путем высвобождения трипсина, дважды промывали охлажденным льдом PBS, ресуспендировали в 500 мкл PBS, фиксировали равным объемом 100% этанола и инкубировали в течение по меньшей мере 12 ч при -20 ° C. Перед анализом проточной цитометрией клетки осаждали, дважды промывали PBS, проникали в 0,1% Triton X-100 / PBS в течение 15 минут на льду, осаждали и затем ресуспендировали в PBS, содержащем 40 мкг / мл йодида пропидия и 25 мкг / мл РНКазы A и инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин. Образцы клеток анализировали на BD FACSCanto II (Becton Dickinson). Сбор данных проводился с использованием программного обеспечения FACSDiva 6.1. Процент клеток в фазах G1, S и G2 / M определяли с помощью программного обеспечения FlowJo.

Иммунофлуоресцентное окрашивание


Клетки MDA-MB 231 (3 × 104) выращивали в полной среде на 4-луночном лабораторном предметном стекле labtek (Nunc) в течение 24 часов, затем обрабатывали указанными концентрациями ОМЕ или равным объемом носителя (этанола) в качестве контроля в течение 24 часов. Затем клетки фиксировали в 10% растворе формалина (4% параформальдегида) (Sigma-Aldrich) в течение 5 минут при комнатной температуре с последующей пермеабилизацией в PBS, содержащем 0,1% тритона Х-100, в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем клетки трижды промывали PBS, блокировали 5% обезжиренным сухим молоком в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре и инкубировали с разведенным первичным антителом в концентрации, рекомендованной производителем, в 1% обезжиренном сухом молоке / PBS в течение ночи при 4 ° С. ° С. После инкубации в течение ночи клетки трижды промывали PBS и помещали на 1 ч при комнатной температуре в присутствии вторичного антитела, конъюгированного с родамином или флуоресцеином, разведенного при 1-200 в 1% обезжиренном сухом молоке / PBS. После отмывки PBS, образцы клеток были установлены в Fluoroschield с DAPI (Sigma-Aldrich) и исследованы под флуоресцентным микроскопом Nikon Ti U.

Клеточный экстракт и Вестерн-блоттинг-анализ


Клетки (1,8 × 106) высевали в 100 мМ культуральные чашки и культивировали в течение 24 ч перед добавлением различных концентраций ОМЕ или равного объема носителя (этанол) в качестве контроля. После инкубации в течение указанного времени клетки дважды промывали ледяным PBS, высвобождали путем утилизации, осаждали и лизировали в буфере RIPA, дополненном коктейлем с ингибитором протеазы / фосфатазы. После инкубации в течение 30 минут на льду клеточный лизат получали центрифугированием при 14000 об / мин в течение 20 минут при 4 ° С. Концентрацию белка в лизатах определяли с помощью набора для анализа белка BCA (23225, Thermo Scientific), а лизаты корректировали с помощью буфера для лизиса. Аликвоты по 25 мкг общих белков разделяли на 10–12% SDS-PAGE. Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны (88018, Thermo Scientific) и блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре с 5% обезжиренного сухого молока в TBST (TBS и 0,05% Tween 20). Инкубацию со специфическими первичными антителами проводили в блокирующем буфере в течение ночи при 4 ° С. В качестве вторичного антитела использовали конъюгированный с пероксидом хрена анти-IgG. Иммунореактивные полосы обнаруживали с помощью хемилюминесцентного субстрата ECL (32209, Thermo Scientific). Стриппинг мембраны путем инкубации мембраны в буфере для удаления блоттинга Restore Western (21059, Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ образования колоний в мягком агаре


Анализы проводились в шести-луночных планшетах. Нижний (базовый) слой состоял из 1 мл 2,4% Благородного агара. Базовый слой покрывали вторым слоем, состоящим из 2,9 мл ростовой среды, 0,3% благородного агара и 3 × 104 клеток MDA-MB-231. Агар при 50 ° С смешивали со средой при 37 ° С, высевали и оставляли для отстаивания на 10 мин. Затем в верхний слой второго слоя добавляли 2 мл ростовой среды. Планшеты инкубировали при 37 ° C, увлажняли и 5% CO2. Клеткам позволяли расти в отсутствие обработки в течение 14 дней до образования видимых колоний. Планшеты кормили два раза в неделю 2 мл обычной полной питательной среды (DMEM).

Через 2 недели чашки снабжали средой, содержащей либо указанные концентрации ОМЕ, либо равный объем носителя (этанол) в качестве контроля, и колониям давали возможность расти в течение еще одной недели. После обработки чашки дважды промывали PBS, а затем колонии фиксировали 10% ледяным метанолом в течение 10 минут и один раз промывали PBS. Колонии оставляли окрашиваться в течение 1 часа в растворе, содержащем 2% Гимзы. Размер колоний измеряли, подсчитывали с использованием микроскопа (10Х), а размер колоний классифицировали как Большой (> 200 мкМ) или маленький (50-200 мкМ). Размеры колоний выражали в процентах от общего количества подсчитанных колоний и затем сравнивали с контрольными животными, обработанными носителем (этанол). Эксперимент был повторен два раза.

Статистический анализ


Результаты выражали как среднее значение ± стандартное отклонение. от количества экспериментов. Был проведен t-критерий Стьюдента для парных или непарных значений, и значение p <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты


Экстракт O. majorana подавляет жизнеспособность клеток рака молочной железы MDA-MB-231

Чтобы исследовать противоопухолевую активность экстракта майорана Origanum (OME) в отношении клеток рака молочной железы, мы сначала измерили влияние различных концентраций экстракта (0, 50, 150, 300, 450 и 600 мкг / мл) на пролиферацию MDA. -MB-231 клеточная линия рака молочной железы. Наши результаты показывают, что воздействие на OME MDA-MB-231 снижало жизнеспособность клеток в зависимости от концентрации и времени. IC50 (вызывающая половинное максимальное ингибирование) составляла приблизительно 350 мкг / мл через 24 часа и 400 мкг / мл через 48 часов обработки.

Наблюдение за обработанными ОМЕ клетками MDA-MB231 под световой микроскопией также показало, что количество клеток уменьшалось при увеличении концентрации. Кроме того, как показано на фигуре 1B, под световым микроскопом наблюдения клеток MDA-MB231, обработанных концентрациями ОМЕ 150, 300 и 450 и 600 мкг / мл, произошли морфологические изменения, характеризующиеся потерей их эпителиальной морфологии, видимой после 24 ч обработки. Также наблюдались шипы эхиноидов и округление клеток, характеристики апоптотических клеток.

Способность противоопухолевого препарата влиять на распределение клеточного цикла может предоставить информацию относительно его цитотоксического механизма (механизмов) действия. По этой причине мы исследовали влияние ОМЕ на распределение клеточного цикла методом проточной цитометрии.

Клетки MDA-MB 231 обрабатывали указанными концентрациями O. majorana в течение 24 часов и подвергали анализу клеточного цикла. При концентрации 150 мкг / мл OME вызывал явный арест G / 2M на этих клетках (фигура 2А). Действительно, популяция G2 / M значительно увеличилась с 23 до 51,7%, поскольку концентрация ОМЕ увеличилась до 150 мкг / мл, что указывает на то, что обработанные ОМЕ клетки MDA-MB-231 были арестованы в фазе G2 / M. Небольшое увеличение популяции sub-G1 (6,2%) указывает на то, что небольшая популяция клеток MDA-MB-231, обработанных ОМЕ, претерпевает гибель клеток, также наблюдалась в этих концентрациях. Аналогичные результаты были получены для 300 мкг / мл ОМЕ (данные не показаны).

Интересно, что при более высоких концентрациях ОМЕ анализ с помощью проточной цитометрии выявил резкое увеличение апоптотической популяции (пик суб-G1), увеличивающееся с 0,9% в контроле до 48,4% и 56,7% в клетках, обработанных 600 и 450 мкг / мл соответственно ,

Чтобы определить, вызывал ли ОМЕ остановку клеточного цикла конкретно в фазе митоза или G2, мы исследовали статус фосфорилирования гистона H3 (Ser 10). Гистон H3 фосфорилируется по серину 10 во время митоза с помощью авроракиназы, а статус фосфорилирования H3 считается маркером митоза. Поэтому мы исследовали экспрессию p (ser10) H3 и обнаружили, что обработка 150 и 300 мкг / мл O. majorana значительно повышает уровень фосфорилирования гистона H3 (Рисунок 2B, верхняя панель).

Этот результат указывает на то, что ОМЕ индуцирует митотическую остановку клеток MDA-MB231. Далее мы исследовали механизм ОМЕ-индуцированной митотической остановки. Хорошо известно, что накопление циклина В1 играет важную роль в переходе G2 / M. Нокдаун циклина B1 с помощью siRNA вызывает остановку клеточного цикла преимущественно в фазе G2, в то время как активация циклина B1 вызывает остановку митоза. Поэтому мы исследовали уровень белка циклина В1 в обработанных ОМЕ клетках MDA-MB-231.

Мы обнаружили, что обработка этими концентрациями ОМЕ, приводящая к остановке митоза, также вызывала увеличение белка циклина В1 в клетках MDA-MB-231, что позволяет предположить, что накопление циклина В1 может играть решающую роль в вызванном ОМ остановка митоза. Взятые вместе, наши данные показывают дифференциальное влияние концентрации ОМЕ на прогрессирование клеточного цикла клеток MDA-MB 231.

Принимая во внимание, что более низкие концентрации ОМЕ (150 и 300 мкг / мл) вызывали значительную остановку митоза с небольшим увеличением апоптотической популяции, более высокие концентрации (450 и 600 мкг / мл) вызывали массовую гибель клеток в результате апоптоза. Снижение жизнеспособности клеток, наблюдаемое в клетках MDA-MB231, обработанных низкими концентрациями ОМЕ, возможно, в значительной степени связано с ингибированием пролиферации клеток, а не с гибелью клеток.

Апоптоз в клетках MDA-MB-231, обработанных OME, дополнительно исследовали путем измерения активации каспазы 3/7 в клетках MDA-MB 231, обработанных различными концентрациями (300, 450 и 600 мкг / мл) OME через 24 часа обработки. Зависимая от концентрации и времени активация каспазы 3/7 была обнаружена в обработанных клетках. Интересно, что расщепление поли (АДФ-рибозо) полимеразы (PARP) происходило только в клетках, обработанных более высоким (450 и 600 мкг / мл), но не при более низких концентрациях (150 и 300 мкг / мл) ОМЕ. Следует отметить, что при этих более низких концентрациях ОМЕ наблюдалась только низкая скорость индукции апоптоза, несмотря на обнаружение активации каспазы 3/7.

Концентрационно-зависимая регуляция экспрессии сурвивина экстрактом O. majorana

Сурвивин, член семейства ингибиторов белка апоптоза (IAP), играет важную роль как в регуляции клеточного цикла, так и в ингибировании апоптоза. Повышение уровня сурвивина в фазе G2 / M придает устойчивость к апоптозу арестованным клеткам G2 / M. Тем не менее, снижение уровня сурвивина повышает чувствительность клеток к апоптозу. В нескольких исследованиях сообщалось, что сурвивин оказывает свое негативное влияние на апоптоз, ингибируя активность каспазы 3, 7 и 9. Поэтому мы исследовали возможное участие сурвивина в аресте и апоптозе клеток, вызванных ОМЕ.

Для этого мы проанализировали с помощью вестерн-блоттинга экспрессию сурвивина в ответ на различные концентрации ОМЕ после 24-часовой обработки. Интересно, что мы наблюдали дифференциальное влияние концентрации ОМЕ на экспрессию сурвивина на клетках MDA-MB-231. Мы обнаружили, что низкие концентрации ОМЕ приводят к значительному увеличению уровня сурвивина, в то время как более высокие концентрации вызывают резкое снижение сурвивина (99%).

На основании этих результатов мы заключаем, что ОМЕ оказывает концентрационно-зависимое действие на клетки MDA-MB-231. Низкие концентрации ОМЕ индуцировали митотически остановленные клетки, что сопровождалось активацией сурвивина, что, в свою очередь, придавало устойчивость к гибели клеток этой популяции клеток, вероятно, за счет ингибирования активности каспазы 3/7, которая отслеживалась по отсутствию расщепления PARP у этих клеток. концентрации. Обработка клеток MDA-MB-231 более высокими концентрациями ОМЕ вызывала резкое снижение экспрессии сурвивина и, как следствие, повышала чувствительность клеток MD-MB-231 к апоптозу.

Экстракт O. majorana активирует внешний путь апоптоза через активацию TNF-α и активацию каспазы 8

Показав, что ОМЕ индуцирует активацию эффекторных каспаз 3/7, мы рассмотрели активность каспаз инициатора внешнего и внутреннего пути гибели клеток, а именно каспазы 8 и каспазы 9 соответственно. Удивительно, что активация каспазы 9 не была обнаружена в ответ на различные концентрации ОМЕ после 24 ч обработки.

С другой стороны, активность каспазы 8 увеличивалась в зависимости от концентрации в ответ на лечение ОМЕ. Этот результат демонстрирует, что апоптотический эффект экстракта на MDA-MB-231 зависит от активности каспазы 8, которая подразумевает только внешний путь гибели клеток, поскольку ни активация каспазы 9, ни изменение отношения Bax / Bcl2 (данные показано) не наблюдалось. После того, как было показано, что внешний путь гибели клеток участвует в OME-зависимом апоптозе, мы затем были заинтересованы в определении того, как этот путь активируется OME.

Мы определили изменения уровня экспрессии фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) в ответ на ОМЭ через 24 ч лечения. Вестерн-блот-анализ выявил явное увеличение уровня TNFα в клетках MDA-MB-231 в ответ на лечение ОМЕ. Повышенная регуляция TNF-α была дополнительно подтверждена иммунофлуоресцентным анализом. Даже несмотря на то, что мы показали, что OME оказывает свое влияние через активацию внешнего пути гибели клеток, мы не можем исключить, что на этом этапе возможность OME-зависимого апоптоза также может быть инициирована другим механизмом.

O. majorana приводит к истощению мутанта р53 в MDA-MB-231 и усилению регуляции p21WAF1 / CIP1

Далее мы протестировали влияние ОМЕ на экспрессию супрессора опухоли р53 в MDA-MB-231. Для достижения этой цели клетки обрабатывали различными концентрациями ОМЕ и определяли уровень белка мутанта р53. Мы обнаружили, что низкие концентрации ОМЕ 150 и 300 мкг / мл приводят к незначительному увеличению уровня белка мутанта р53. Самое важное, что вестерн-блоттинг-анализ показал, что концентрации апоптоза (450 и 600 мкг / мл ОМЕ) приводили к почти полному истощению мутанта р53 в клетках MDA-MB-231.

Этот результат является потенциально важным открытием из-за роли мутантного белка р53 в раке человека. Поскольку мутантный р53 делает раковые клетки более устойчивыми к противоопухолевым препаратам, устранение мутантного р53 может, следовательно, предложить многообещающий подход для профилактики и лечения рака.

Клетки обрабатывали различными концентрациями (150, 300, 450 и 600 мкг / мл) ОМЕ или равным объемом носителя (этанола) в качестве контроля в течение 24 часов, и экспрессию мутантов р53, р21 и β-актина оценивали вестерн-блоттингом. ,

Поскольку сообщалось, что белок р21 ингибирует рост и апоптоз, мы исследовали, было ли ингибирование роста, опосредованное низкими концентрациями (150 и 300 мкг / мл ОМЕ), также связано с индукцией р21. Вестерн-блоттинг показал повышенную регуляцию белка р21 с по меньшей мере 2,5-кратным увеличением в клетках, обработанных низкими концентрациями ОМЕ, в то время как при более высоких концентрациях ОМЕ наблюдалось небольшое влияние или вообще не наблюдалось влияние на экспрессию р21.

Основываясь на этом, мы можем постулировать, что активация p21 способствует, по крайней мере частично, остановке клеточного цикла, наблюдаемой при более низких концентрациях, в то время как он играет небольшую роль или не играет роли в гибели клеток, происходящей при более высоких концентрациях ОМЕ.

Экстракт O. majorana вызывает гиперацетилирование гистона H3 и H4 в клетках MDA-MB 231

Ранее экспрессия р21 и повышенное гиперацетилирование гистонов были связаны с апоптозом и задержкой роста. Таким образом, мы исследовали профиль ацетилирования гистонов H3 и H4 в MDA-MB-231 в ответ на лечение в течение 24 ч на повышение концентрации ОМЕ.

Анализ динамики времени показал постепенное увеличение ацетилированных гистонов, Н3 и Н4. Заметное общее повышение статуса ацетилирования гистонов H3 и H4 также было обнаружено с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания.

В целом, эти результаты показали, что ОМЕ индуцировал гиперацетилирование гистонов H3 и H4.

Накопление γH2AX, маркера двухцепочечных разрывов, в клетках MDA-MB 231, обработанных экстрактом O. majorana

Мы стремились выяснить, вызывало ли ОМЕ повреждение ДНК в клетках MDA-MB-231. Для этого клетки MDA-MB 231 культивировали в течение 6 и 24 ч в полной среде, содержащей либо этанол (контроль), либо повышенные концентрации ОМЕ (75, 150, 300, 450 и 600 мкг / мл). Повреждения ДНК определяли путем измерения уровней фосфорилированного H2AX (γH2AX) после 6 и 24 ч обработки клеток MDA-MB-231 ОМЕ. Вестерн-блоттинг-анализ выявил зависящее от времени и концентрации увеличение уровней γH2AX в ответ на лечение ОМЕ, что указывает на накопление двухцепочечных разрывов в этих клетках.

Увеличение повреждения ДНК также оценивали по иммунофлуоресцентному окрашиванию γH2AX в клетках, обработанных 150, 300 и 450 мкг / мл ОМЕ в течение 24 часов. На фигуре 7C четко показано зависящее от концентрации увеличение очагов γH2AX в ответ на OME. Поскольку активация γH2AX происходила уже в течение 6 часов, времени, когда не наблюдались ни гибель клеток (данные не показаны), ни активация каспазы 3/7, это исключает возможность того, что последующее повреждение ДНК является следствием фрагментации ДНК, возникающей в результате активности каспаз, и еще раз подтверждает способность этого экстракта ОМЕ вызывать двухцепочечные разрывы ДНК в зависимости от дозы.

O. majorana препятствует росту колоний MDA-MB-231

Чтобы дополнительно подтвердить ингибирующий потенциал O. majorana на клетках MDA-MB 231, мы попытались определить, может ли OME ингибировать дальнейший рост уже сформированных колоний MDA-MB-231. Для этого сначала клеткам MDA-MB-231 давали возможность расти и образовывать видимые колонии в отсутствие лечения. После 14 дней роста колонии инкубировали с этанолом в качестве контроля и с ОМЕ и давали возможность расти еще одну неделю.

Размер обработанных этанолом (контрольных) колоний продолжал расти по сравнению с размером двухнедельных колоний; более крупные колонии были получены на трехнедельном планшете, в то время как были подсчитаны менее мелкие колонии, что указывает на то, что маленькие колонии стали больше по размеру. Интересно, что в колониях, обработанных ОМ, наблюдается регрессия в размере колоний по сравнению с колониями двух недель.

В чашках, обработанных ОМ, количество подсчитанных колоний большого размера было меньше, чем было получено на двухнедельной чашке, тогда как число маленьких колоний было значительно больше, что предполагает регрессию размера в большой колонии, индуцированной ОМЕ. Этот результат наряду с данными по жизнеспособности и проточной цитометрии подтверждают противораковое действие ОМЕ на клетки тройного отрицательного мутанта p53 MDA-MB-231 рака молочной железы.

Резюме

Обычные лекарства для лечения рака направлены на подавление прогрессирования клеточного цикла и на индукцию клеточной гибели и апоптоза. Химиопрофилактика рака с помощью этих двух событий (остановка клеточного цикла и апоптоз) была отмечена для нескольких природных соединений.

В настоящем исследовании мы показали, что экстракт этанольной фракции Origanum majorana ингибировал пролиферацию мутантной клеточной линии тройного негативного рака молочной железы p53 (TNBC), MDA-MB-231. Мы также продемонстрировали, что ОМЕ вызывает дифференциально-зависимый от концентрации эффект на эти клетки. OME вызывает остановку клеточного цикла в фазе G2 / M и, точнее, остановку митоза при низких концентрациях.

Это открытие подтверждается многочисленными данными: (i) повышение уровня p (ser10) H3, митотического маркера, и (ii) повышение уровня белка циклина B1, положительная регуляция которого отмечена в нескольких митотически арестованных клетках. 

Мы также показали, что остановка клеточного цикла коррелирует с активацией ингибитора CDK p21 и антиапоптотического белка сурвивин. Однако при высоких концентрациях ОМЕ индуцировал массивный апоптоз, о чем свидетельствует резкий рост популяции суб-G1.

Мы продемонстрировали, что ОМЕ проявляет свой апоптотический эффект, активируя внешний путь гибели клеток, опосредованный, по крайней мере частично, активацией TNF-α. Мы также показали, что OME-индуцированный апоптоз также опосредован увеличением повреждения ДНК, выявленным активацией γH2AX, сильным истощением мутантного белка p53 и сурвивина из обработанных клеток.

Процесс апоптоза может быть индуцирован либо внешним путем, который включает передачу сигналов от рецепторов смерти на поверхности клетки, либо внутренним митохондриально-опосредованным путем. Активация апоптоза, опосредованного рецептором смерти, требует взаимодействия лигандов, таких как TNF-α и Fas, с их трансмембранными рецепторами.

Взаимодействие лиганд-рецептор приводит к активации эффекторной каспазы 8, которая, в свою очередь, активирует эффекторную каспазу 3 непосредственно и / или через митохондрии. Опосредованный митохондриями путь апоптоза связан с пермеабилизацией наружной мембраны митохондрий, сниженным потенциалом митохондриальной мембраны (Δm), изменением экспрессии антиапоптотических членов семейства Bcl2, таких как Bcl2 и Bcl-XL, и проапоптотических членов, таких как как Bax и Bak, приводящие к образованию апоптосомы, активации каспазы 9 и, следовательно, активации каспазы 3.

Внутренние и внешние патофазы активируют расщепление каспазы-3 поли (АДФ-рибоза) полимеразы (PARP), что приводит к апоптозу. В настоящем исследовании мы показали, что OME индуцирует TNF-α-опосредованный внешний апоптотический путь. Рецептор TNF-α активировали через 24 ч и индуцировали передачу сигналов вниз по течению, такую как каспаза 8, каспаза 3 и расщепление PARP.

С другой стороны, ОМЕ не индуцировал митохондриально-опосредованный путь апоптоза, так как не было обнаружено никаких изменений в соотношении BAX / Bcl2 или активации каспазы 9. Мы предполагаем, что OME индуцирует апоптоз исключительно через сигнальный путь, активированный TNF-α, в клетках MDA-MB-231.

Исследования показали, что повреждение ДНК является одним из молекулярных событий, связанных с остановкой клеточного цикла и апоптозом. Действительно, и было показано, что многие противораковые препараты вызывают повреждение ДНК. Более того, раковые клетки, как сообщается, более восприимчивы, чем нормальные клетки, к агентам, повреждающим ДНК, поэтому существует растущий интерес к пищевым фитохимическим веществам, которые обладают активностью, повреждающей ДНК.

В настоящем исследовании мы показали, что OME вызывал повреждение ДНК, измеряемое увеличением зависимого от концентрации маркера повреждения ДНК, γ-H2AX, после обработки OME в течение 6 или 24 часов. Дифференциальный ответ на различные концентрации ОМЕ (арест G2 / M и / или апоптоз) может быть частично опосредован степенью повреждения ДНК, произошедшего в геноме.

Низкие уровни повреждения ДНК могут инициировать рекрутирование комплексов репарации ДНК, экспрессию антиапоптотических белков и белков выживания, что приводит к остановке клеточного цикла до восстановления генотоксических повреждений. В этом случае белок выживания, такой как сурвивин, активируется для поддержания жизнеспособности арестованных клеток G2 / M.

С другой стороны, когда геномы перегружены повреждением ДНК, клетки уничтожаются путем апоптоза. В этом исследовании мы обнаружили, что высокие концентрации ОМЕ вызывают высокий уровень повреждения ДНК в геноме, что приводит к апоптозу клеток. Наши данные позволяют предположить, что майоран Origanum обладает генотоксическим действием на клетки MDA-MB-231. На этой стадии механизм (ы), с помощью которого ОМЕ вызывает повреждение ДНК, остается (и) неизвестным и, безусловно, заслуживает дальнейшего изучения.

Ингибитор белков апоптоза (IAP), который включает сурвивин, представляет собой семейство антиапоптотических белков, которые связывают и инактивируют активную каспазу 3, 7 и каспазу 9 и могут модулировать деление клеток и клеточный цикл. прогрессия.

Интересно, что сурвивин не влияет на активность каспазы 8. Было показано, что сурвивин высоко экспрессируется в большинстве раковых заболеваний, где он действует как ингибитор апоптоза. Было показано, что при раке молочной железы сверхэкспрессированный сурвивин защищает клетки от апоптоза, вызванного химиотерапевтическими агентами, такими как этопозид.

На основании этих сообщений белок сурвивина представляет собой привлекательную мишень, имеющую особое значение в лечении рака в целом и в лечении рака молочной железы в частности. Принимая во внимание признанную роль сурвивина в качестве хранителя выживаемости раковых клеток, наши результаты показывают, что OME может оказывать свои цитотоксические противораковые эффекты, по крайней мере, частично через подавление сурвивина.

В нашем исследовании мы показали, что экспрессия сурвивина дифференцированно регулируется в зависимости от концентрации OME. Более низкие концентрации ОМЕ вызывали активацию сурвивина, что заставляло клетки останавливать деление клеток и сопротивляться апоптозу, подавляя программу гибели клеток. Фактически, мы показали, что в этих арестованных клетках расщепление PARP не было обнаружено, несмотря на активацию каспазы 3/7. Этот эффект может быть опосредован ингибированием активного 3/7 активированным сурвивином. Функция выживания может также учитывать митотическую остановку, вызванную ОМЕ. Фактически, также было показано, что сурвивин необходим для митотической остановки клеток Hela, индуцированной противораковым препаратом UCN-01.

Обнаружено, что белок-супрессор опухолей р53 мутирует примерно в 50% случаев рака у человека. Сообщается, что мутант р53 играет ключевую роль в устойчивости раковых клеток к определенным противораковым препаратам и, таким образом, рассматривается как потенциальная специфическая для рака мишень для фармакологических вмешательств. Исследования показали, что ингибирование мутанта р53 интерференцией РНК сенсибилизирует гибель раковых клеток к клеткам химиотерапевтическими агентами.

Ван и соавт. 2011, показали, что встречающиеся в природе изотиоцианаты (ITC) фенетилизоизотиоцианат (PEITC), полученные из кресс-салата, и синтетический ITC, 2,2-ди фенетилизоизотиоцианат селективно истощают мутант, но не p53 дикого типа, и вызывают апоптоз у многие раковые клетки, в том числе клетки рака молочной железы MDA-MB-231.

Здесь мы показали, что ОМЕ приводит к резкому снижению уровня мутанта р53 в клетках MDA-MB-231. Таким образом, истощение мутанта р53 может быть важной мишенью для химиопрофилактики и терапии О. majorana для TNBC.

Повышение экспрессии ингибитора циклин-зависимой киназы, р21, как было показано, усиливает арест G2 / M с помощью p53-независимого механизма при раке молочной железы человека. В большинстве случаев задержка роста была связана с апоптозом. В этом исследовании мы показали, что низкие концентрации лечения ОМЕ приводят к остановке G2 / M без значительного увеличения гибели клеток после 24-часовой обработки. Было показано, что гиперацетилирование гистонов напрямую связано с повышением уровня р21, и эта активация также может происходить независимо от р53.

Кроме того, было показано, что гиперацетилирование гистонов связано с подавлением роста и апоптозом. Наши данные показали, что OME индуцировал гиперацетилирование гистонов H3 и H4 в клетках MDA-MB-231, что позволяет предположить, что эффекты OME против рака молочной железы, по крайней мере, частично опосредованы гиперацетилированием гистонов H3 и H4 путем регуляции экспрессии генов, контролирующих эти два События.

Механизм, посредством которого ОМЕ индуцирует гиперацетилирование гистонов, может включать активность ингибитора гистондеацетилазы (ИЧР). Интересно, что растение O. majorana содержит лютеолин, диетический флавоноид с активностью ИЧР. Фактически, лютеолин способен снижать жизнеспособность клеток рака легких, толстой кишки, печени и молочной железы и вызывать гиперацетилирование гистонов H3 и H4.

В свете этих данных мы заключаем, что гиперацетилирование гистонов, индуцированное ОМЕ, связано с HDI-активностью лютеолина. В настоящее время мы проводим дальнейшие исследования, чтобы лучше понять механизм (ы), с помощью которого ОМЕ индуцирует гиперацетилирование гистонов.

В заключение, наши данные согласуются с моделью, показанной на рисунке 9, которая показывает зависимый от концентрации дифференциальный эффект экстракта O.majorana на мутантные p53, тройные негативные клетки MDA-MB-231. При низких концентрациях ОМЕ индуцировал митотический арест, связанный с низким уровнем повреждения ДНК, активацией ингибитора CDK p21 и ингибитора апоптоза сурвивина.

Мы полагаем, что эти события наряду с другими «еще не установленными» событиями способствуют аресту клеточного цикла. Кроме того, мы также предлагаем, чтобы при этих концентрациях сурвивин также участвовал в блокаде пути апоптоза, опосредованного ФНО, путем непосредственного ингибирования активности активной каспазы 3. С другой стороны, высокие концентрации ОМЕ вызывают массивный апоптоз посредством активация внешнего пути TNF-α, которая связана с высоким уровнем повреждения ДНК и почти полным истощением мутантного p53 и выживших белков из этих клеток. Наши результаты дают первый случай потенциальной роли OME как средства против рака молочной железы in vitro, что, безусловно, заслуживает большего внимания для дальнейших исследований по выявлению новых соединений для рака молочной железы.

Предложенные сигнальные пути при остановке клеточного цикла, вызванном О. majorana, в низких концентрациях и апоптоз в высоких концентрациях в клетках MDA-MB-231 рака молочной железы человека с тройной негативной мутацией p53.

Подтверждения


Мы благодарим профессора Джоан Массаге из Медицинского института Говарда Хьюза за предоставление клеток MDA-MB-231. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Мохамеда Тахара Муссу за его вклад в подтверждение идентичности майоранов Origanum, использованных в этом исследовании. Мы также благодарны Холуду Арафату за ее неоценимую техническую помощь.

Заявление о финансировании


Эта работа была поддержана междисциплинарным исследовательским грантом Факультета науки Университета ОАЭ и исследовательским грантом Фонда Эмиратов (2009–80) Р. Иратни. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Слово от Health-Ambulance


Всем СЧАСТЬЯ и ЗДОРОВЬЯ!

Регистрация